石陸娥1,2 應(yīng)國(guó)清2 唐振興1 易其喻2 熊文說
（1. 浙江工業(yè)大學(xué)化學(xué)工程與材料學(xué)院；2.浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院：杭州 310014）
在超臨界條件下，溫度和壓力的改變可以影響流體的密度，因此諸如一些由密度決定的常數(shù)如介電常數(shù)，溶解度等就能很好地控制。對(duì)于工業(yè)生產(chǎn)可以使生物催化反應(yīng)和產(chǎn)物的分離同時(shí)進(jìn)行，實(shí)現(xiàn)偶聯(lián)操作，在許多的情況下，酶催化反應(yīng)在有機(jī)溶劑中因?yàn)榉磻?yīng)太慢而不能應(yīng)用于工業(yè)化大生產(chǎn)。但是在超臨界流體中，由于它很小的傳質(zhì)阻力，使得反應(yīng)能很快進(jìn)行，而且有機(jī)溶劑在超臨界流體（SCF）中的溶解能力很好；同時(shí)它的下游處理和溶劑回收也更加方便。對(duì)手性化合物合成和外消旋體拆分的則是良好反應(yīng)體系。
正是這些優(yōu)點(diǎn)，使得超臨界流體技術(shù)在酶催化反應(yīng)等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。在酶催化反應(yīng)中，目前研究的較多的流體有乙烷、乙烯、三氯甲烷、六氟化硫和CO2等，其中CO2是應(yīng)用的最廣泛的流體，CO2安全、無毒，它的臨界溫度為31.1℃，接近室溫，可以使熱源性物質(zhì)不會(huì)因?yàn)闇囟鹊年P(guān)系而變性或失活；而且臨界壓力為7.4MPa，適宜工業(yè)化大生產(chǎn)。
1 影響因素
1.1 介質(zhì)水含量
實(shí)驗(yàn)表明，超臨界條件下的酶催化反應(yīng)體系中固相（酶及載體）必須含有水，哪怕只是薄薄的一層水分子覆在酶表面，水的存在是為了維持酶的活性及其構(gòu)象。Randolph對(duì)于膽固醇氧化酶中的水含量研究發(fā)現(xiàn)，如果系統(tǒng)中沒有水的話，酶活將只有有水時(shí)候的10％，然而一旦加入1％（體積分?jǐn)?shù)）的水進(jìn)入系統(tǒng)后，膽固醇氧化酶的活力又恢復(fù)了。
如果加入了比較多的水，正如R Goddard等人報(bào)道，在超臨界CO2中油酸和乙醇的酯化反應(yīng)中，當(dāng)水含量達(dá)到15％（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）時(shí)，酶活力最高，繼續(xù)加水則酶活力下降，他們解釋為過多的水在酶附近會(huì)形成親水性障礙層使得酶活力降低。到底多少的系統(tǒng)含水量才最合適呢？Condoret等人認(rèn)為在SC CO2中脂肪酶催化反應(yīng)的最佳水含量為8％~12％（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。主要有4個(gè)因素影響最佳水含量。
（1）所用流體的極性。Domont報(bào)道在SC CO2和乙烷中脂肪酶催化十四烷和乙醇的反應(yīng),在CO2中最合適水量比在乙烷要大幾十倍。他認(rèn)為這是由于CO2的親水性比乙烷強(qiáng)。同樣Kamat等人實(shí)驗(yàn)表明，親水性的溶劑趨向于將水從酶和載體中拉到溶劑中，所以在酶催化反應(yīng)中，最大的酶活往往是在疏水性溶劑中達(dá)到的。
（2）酶的載體。Condoret等人研究了水在超臨界CO2和不同的載體的分配關(guān)系，結(jié)果表明，由于實(shí)驗(yàn)環(huán)境對(duì)其平衡有很大的影響，所以不能很精確地估計(jì)流體中有多少水含量，載體有多少水。Bosley等人也認(rèn)為載體與酶表面的結(jié)合水有關(guān)系，并且指出在相同的水含量下，酶在親水性載體表現(xiàn)出較小的活性。這與Kamat的觀點(diǎn)類似。
（3）酶催化反應(yīng)類型。在酯化反應(yīng)中，水是生成物，而在水解反應(yīng)中水卻是反應(yīng)物被消耗。因此在不同類型反應(yīng)中最佳水含量是肯定不同的，學(xué)者們的實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了這個(gè)觀點(diǎn)。Dumont報(bào)道在超臨界乙醇中十四烷酸的反應(yīng)（12.5MPa，323K）中，只有系統(tǒng)中含水量很大時(shí)，才會(huì)達(dá)到最大的反應(yīng)速率；Miller等人研究了在超臨界CO2中十四烷酸同甘油三月桂酸酯的反應(yīng)（9.5MPa，308K），他們認(rèn)為只有當(dāng)系統(tǒng)的含水量很低的時(shí)候才有較高的酶活。Srivastava等人也持同樣的觀點(diǎn)，他們?cè)诔R界CO2進(jìn)行了肉豆蔻酸的酯交換反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)水的添加會(huì)導(dǎo)致肉豆蔻酸的酯化率呈指數(shù)級(jí)的下降（圖1）；他們?yōu)榇藢O2氣體通過硅土床，從而使得含水量減少，酯化率也從19％上升到22％。
（4）水的添加方式。Steytler在SC CO2下（30MPa，40℃），用Candida脂肪酶催化丁酸和月桂酸的合成，發(fā)現(xiàn)在反應(yīng)器填充完全后再加水到催化劑床層上，酶活將會(huì)比較高；如果是直接將水加入到容器中和酶充分接觸，那么酶活會(huì)很低。
另外有學(xué)者認(rèn)為系統(tǒng)含水量對(duì)于最初反應(yīng)速率及酶活和穩(wěn)定性有一定的關(guān)系Nakamura在超臨界CO2和n-hexane中,發(fā)現(xiàn)當(dāng)水含量不足1％（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）時(shí)，最初反應(yīng)速率并沒有因?yàn)榱黧w的不同而有差異，但是系統(tǒng)中的含水量超過了20％（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）后，在CO2的最初反應(yīng)速率要比在n-hexane中大4倍。Ma人ty對(duì)于固定化酶的研究發(fā)現(xiàn)，如果系統(tǒng)中含有水，那么酶的穩(wěn)定性將會(huì)下降。但是也有學(xué)者有相反的觀點(diǎn)。Sovova等人在SC CO2中黑醋栗油的酶催水解反應(yīng)發(fā)現(xiàn)，CO2中的水含量對(duì)于反應(yīng)速率幾乎沒有影響。
1.2 溫度和壓力
如前所述，溫度和壓力的微小改變會(huì)導(dǎo)致流體的密度大幅度的改變，從而改變流體的物理性質(zhì)及反應(yīng)機(jī)制，但對(duì)于酶活及酶本身的選擇性和穩(wěn)定性也都有影響，在臨界點(diǎn)附近這種影響更加明顯。Matsuda等人在SC CO2中通過改變溫度和壓力從而改變3-氟甲基對(duì)氯苯基甲醇的立體選擇性的酶催化反應(yīng)，這個(gè)結(jié)果符合Eyring 關(guān)于溫度對(duì)于物質(zhì)的立體化學(xué)結(jié)構(gòu)影響的理論。Srivastava研究了溫度從30℃到75℃對(duì)于該催化反應(yīng)的影響。他們實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，酯化率由35℃時(shí)的12％上升到45℃的19％，但是隨著溫度的持續(xù)上升，酯化率卻下降，直到70℃的3％。他認(rèn)為這不是酶失活的原因，因?yàn)橥沁@個(gè)酶在超臨界CO2下十二酸酯的水解反應(yīng)中，在,65℃下有最高的水解率，在超臨界CO2下酶的穩(wěn)定性還是很好的。kamat等人證實(shí)了壓力對(duì)于超臨界三氟甲烷流體的物理性質(zhì)的影響，即每當(dāng)增加13.8MPa就會(huì)導(dǎo)致4％的三氟甲烷的介電常數(shù)的提高。Eyring等人認(rèn)為壓力對(duì)于反應(yīng)機(jī)制也是個(gè)影響因素，并且他們還提出了Eyring形態(tài)轉(zhuǎn)變理論，用來解釋壓力對(duì)于反應(yīng)速率的影響。Oliveira在SC CO2流體下用脂肪酶催化棕櫚油的反應(yīng)表明，最初反應(yīng)速率（％/min，丙三醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)） 從6MPa的13.09％提高到9MPa的28.15；但是繼續(xù)增加壓力，反應(yīng)速率急劇下降，在20MPa時(shí)只有6.66。他認(rèn)為在SCF中的酶催化反應(yīng)的最大反應(yīng)速率應(yīng)該在流體的臨界點(diǎn)附近。
Chaudhary等人指出隨著超臨界三氟甲烷的壓力的改變，枯草桿菌蛋白酶的活力和選擇性也會(huì)大幅度的變化，原因是壓力的變化改變了溶劑的物理性質(zhì)，而酶的結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生改變。Randolph也有同樣的觀點(diǎn)，通過核磁共振譜圖發(fā)現(xiàn)，在SC CO2流體下，壓力對(duì)于膽固醇氧化酶的結(jié)構(gòu)幾乎沒有影響。
但是也有學(xué)者認(rèn)為正是壓力的改變誘導(dǎo)了酶的結(jié)構(gòu)和功能的變化，從而導(dǎo)致了酶活的改變。
1.3 底物及產(chǎn)物含量
Srivastava在該實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，如果底物（乙醇）用量過多的話將會(huì)導(dǎo)致酶的催化能力的弱化。R Goddard也有同樣的觀點(diǎn)，他認(rèn)為當(dāng)親水性的底物如乙醇加入的量過多，會(huì)改變水在超臨界流體中的分配，使得固定化酶中的水分丟失以至酶活減少。
Endo Yasushi認(rèn)為在超臨界流體酯交換反應(yīng)過程中，如果選擇性的把反應(yīng)產(chǎn)物分離出反應(yīng)體系中，那么可以提高酯交換率。 陳惠晴在超臨界CO2中用假絲酵母脂肪酶催化月桂酸和正丁醇反應(yīng)，她發(fā)現(xiàn)當(dāng)正丁醇濃度小于100mmol/L，反應(yīng)速率隨著濃度的增加而提高，但是正丁醇濃度從100mmol/L增加到400mmol/L， 反應(yīng)速率下降了60％。
1.4 夾帶劑
有機(jī)溶劑在超臨界流體中的溶解能力很好；如果是極性有機(jī)物在非極性的流體中反應(yīng)，那么它的溶解度就很小了，使得反應(yīng)速度減慢。為此，采取了添加極性?shī)A帶劑（乙醇、水等）的方法。Randolph研究表明乙醇能明顯提高酶催化反應(yīng)速率。Capewell在3-羥基酯的酶催化反應(yīng)中添加了丙酮、癸烷等夾帶劑，發(fā)現(xiàn)它們對(duì)于反應(yīng)并沒有太大的影響，只有癸烷能提高對(duì)映體過量值（ee）及轉(zhuǎn)化率。在實(shí)際的大生產(chǎn)中，夾帶劑的添加將會(huì)使得產(chǎn)物的分離變得更加復(fù)雜，并且有可能有副產(chǎn)物的生成。因此應(yīng)根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)決定合適的夾帶劑。
2 反應(yīng)機(jī)理
超臨界流體的特殊性質(zhì)決定了它的反應(yīng)機(jī)理的復(fù)雜性。Kamat認(rèn)為，甲基丙烯酸甲酯和乙基己醇的反應(yīng)在所有非水體系的反應(yīng)機(jī)理應(yīng)該是大致相同的。他認(rèn)為在超臨界乙烷中該反應(yīng)可以用米氏方程來表示，并且還符合底物（乙基己醇）抑制的Ping-Pong Bi-Bi機(jī)理。他解釋這可能是酶首先和底物生成不可逆的復(fù)合物，或者是和甲基丙烯酸甲酯（MMA）生成復(fù)合物，這種復(fù)合物能和甲醇形成一種酰酶的中間產(chǎn)物，這個(gè)中間產(chǎn)物隨后和底物生成二元復(fù)合物，使得它能夠分離出產(chǎn)物和游離酶。R Goddard，Marty和Dumont等人也有類似的觀點(diǎn)。其中R Goddard還發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)孜铮ㄒ掖迹┑牧繛?50mmol時(shí)，表現(xiàn)為競(jìng)爭(zhēng)性抑制反應(yīng)，當(dāng)乙醇的量為300mmol，那么就表現(xiàn)為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制反應(yīng)了。Marty也建立了在超臨界CO2中油酸和乙醇反應(yīng)的合適模型。
3 在合成和拆分手性藥物上的應(yīng)用
手性藥物的制備已經(jīng)成為世界醫(yī)藥領(lǐng)域新的研究熱點(diǎn)，學(xué)者們分別采用不同的方法來得到具有生物活性的手性化合物。由于旋光異構(gòu)體之間的物化性質(zhì)太相近，用傳統(tǒng)的合成后再拆分的方法效果不是很好。酶的高度區(qū)域選擇性和立體專一性，決定了在這一領(lǐng)域酶催化反應(yīng)具有廣闊的應(yīng)用潛力。
許多文獻(xiàn)報(bào)道，在傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑酶反應(yīng)就有很好的立體選擇性，所以在超臨界流體下的立體選擇性還沒有更多的闡明。很多的情況下，在超臨界流體中進(jìn)行手性藥物的合成比在有機(jī)溶劑中的效果更好，有的ee值甚至達(dá)到了99％。如Mase等人指出，丙二酸二乙酯的酶催化反應(yīng)如果在己烷等6種不同有機(jī)溶劑中進(jìn)行，那么ee值幾乎為0；而在SC CO2中，ee值可以達(dá)到50％，同時(shí)轉(zhuǎn)化率也達(dá)到了41％。他解釋這是因?yàn)槊傅幕钚圆课辉诔R界條件下隨著壓力的變化發(fā)生了結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變。根據(jù)這個(gè)設(shè)想，他推出了這個(gè)反應(yīng)的對(duì)映體選擇性可能機(jī)制。
Hartmann等人也認(rèn)為在SC CO2中的立體選擇性要比在己烷中好，他認(rèn)為在己烷中酶的失活與氨基甲酸鹽有一定的關(guān)系。另外有許多學(xué)者就溫度、壓力以及底物濃度等參數(shù)對(duì)于對(duì)映體選擇性的影響進(jìn)行了研究。
如表1，在合成和拆分手性化合物的應(yīng)用方面，學(xué)者們的研究主要集中在超臨界CO2和脂肪酶。因此，開發(fā)出新的高效的流體和酶使之更好地應(yīng)用于實(shí)際大生產(chǎn)中將是今后的研究目標(biāo)。
4 結(jié)束語
超臨界流體作為一種獨(dú)特的非水反應(yīng)介質(zhì)，與有機(jī)溶劑比較它有許多的優(yōu)點(diǎn)，它可以替代許多的有機(jī)溶劑。目前，大部分工作只停留在實(shí)驗(yàn)研究，而且流體和酶的選擇過于集中。因此，如何使得這項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用于實(shí)際的大生產(chǎn)尤其是在手性藥物合成和拆分方面的應(yīng)用將是今后研究的方向。